血庫檢驗方法

17.1.1試管法凝集試驗與價數判讀

凝集價數的判定提供反應強度的比較基準，有助於 ABO 亞型的篩檢或抗體特異性分析。熟練價數判讀手法與準則、達到良好的操作再現性及與同儕之一致性，是血庫入門人員最優先的功課。試管法相當普及、應用最廣且最具彈性，臨床作業多使用 12×75 mm 康氏管（玻璃或塑膠材質）與塑膠滴管操作。

• 血庫專用離心機可固定或設定相當 1000×g 的離心轉速；凝集價數判讀時離心 15 秒，洗滌血球時離心 60 秒（可視定期功能測試結果微調）。
• 常見廠牌：SEROFUGE 為 3,400 rpm 固定轉速，以旋鈕或按鍵設定離心時間；KUBOTA 以按鈕選擇固定離心程式（3,100 rpm，15 秒與 60 秒）；DIAMED 可按鍵設定離心轉速與時間，最大轉速 3,000 rpm。

• 依實驗需求加一滴 2～5% 紅血球懸浮液與適量病人血清或試劑，輕搖混勻。
• 以標準離心速度（相當於 1000×g）離心 15 秒。
• 離心後立刻取出試管觀察，先檢視有無 溶血現象，若有則標記；若無則繼續傾斜試管輕輕搖動，重懸底部的紅血球團（cell button）。
• 觀察血球被搖散時呈現的狀態，記錄價數（國內多採用價數判讀）。
• 必要時輔以顯微鏡低倍鏡觀察，尤其是懷疑有極弱反應或 混合視野型（mixed-field）反應時。

• 從試管底部紅血球團的大小，可判斷 2～5% 紅血球懸浮液是否泡製正確：初學者可以 1 滴離心後的檢體紅血球濃厚液加 32 滴生理食鹽水（約 1.6 mL）；熟練的醫檢師以目測懸浮液顏色即可泡出適當濃度。
• 血清與血球的加入順序基本上不影響結果，但以 先加血清為宜：加了血球後即難以肉眼檢視是否漏加血清；且先滴加的血球若置放稍久會沉降管底，加血清反應前需先混合均勻，以免阻礙抗原抗體充分反應。
• 完全或部分溶血標記「H」或「PH」，表示試管內 已活化補體，視為陽性反應（但應排除人為因素）；偶見於以病人血清檢體操作 ABO 血清分型或間接抗球蛋白試驗，較罕見於血漿檢體反應。
• 除凝集塊大小外，應仔細觀察並記錄是否有 鬆散凝塊、線狀凝塊、具折光性凝塊或混合視野型結果，可能對解決問題有所幫助，例如某些抗體特異性（anti-Luᵃ、anti-Sdᵃ 等）或輸血後檢體。
• 常規實驗是否於肉眼判讀後再以顯微鏡觀察仍有爭議：經驗不足者有時誤把血清中 纖維塊導致的紅血球團誤判為陽性；但懷疑極弱反應或混合視野型時又非常有幫助。某些試劑（酵素處理過的血球或抗血清）會引起極微弱或緡錢狀凝集，試劑說明書會強調 限用肉眼觀察。

17.1.2管柱凝集分析法（凝膠試驗）

不同廠牌的卡片尺寸與填充物質均有不同，需搭配特定的離心條件，亦多發展為搭配 自動化機台使用。以下以某廠牌卡片手工操作 DAT 為例。

• 泡製 1% 紅血球懸浮液：10 μL 離心過的檢體紅血球（packed cells）與 1 mL 專用稀釋液混合。
• 取抗球蛋白試劑卡片，撕開封口鋁箔，每反應管柱加入 50 μL 紅血球懸浮液，於卡片專用離心機 離心 10 分鐘（依特定廠牌說明）。
• 取出卡片肉眼觀察，記錄價數。

17.2.1–17.2.2抗球蛋白試驗：DAT 與 IAT 的原理與試劑

抗球蛋白試驗在 1908 年發現，1945 年 Coombs 才將這個方法應用在臨床診斷上。偵測病人血清中是否有 不完全抗體對抗 RBC 抗原，稱間接抗球蛋白試驗（IAT, indirect antiglobulin test, indirect Coombs test）；也可測紅血球是否在體內已和抗體反應（敏感化），稱直接抗球蛋白試驗（DAT, direct antiglobulin test, direct Coombs test）。

• DAT：直接檢測檢體紅血球上是否附著 IgG 或補體，顯示人體內（in vivo）是否曾有抗原抗體反應。臨床應用：新生兒溶血症診斷、輸血反應調查（異體抗體引起）、自體免疫溶血性貧血之診斷、藥物引起溶血之調查。
• IAT：檢測體外（in vitro）反應，利用特定紅血球或血清，檢測試管中是否有對應的抗原抗體反應。臨床應用：紅血球抗體篩檢、紅血球抗體鑑定、紅血球血型抗原測定、交叉試驗。

常規使用的 AHG 主要為多特異性含 anti-IgG 及 anti-C3d 的 polyspecific AHG，亦可能含少量 anti-C3b、anti-C4b、anti-IgA 等成分；以人類球蛋白（主要是 IgG 及 C3d）免疫動物（常用 兔子及山羊），再從免疫動物的血清製造出來。

*除 heavy chain specific 的 anti-IgG 外，AHG 的 anti-IgG 均對抗 IgG 之 Fc portion。

17.2.3DAT 實驗方法（試管法）

檢體為含抗凝固劑的血（EDTA 或 citrate）1 mL。

• 以生理食鹽水製備 2～5% 病人紅血球懸浮液少許。
• 分別標示兩支試管「Test」與「Control」，各加入一滴待測紅血球懸浮液。
• 加入足量 3～4 mL 生理食鹽水，離心 1 分鐘，立即取出並快速倒乾生理食鹽水，輕搖開試管底部之紅血球——此即抗球蛋白實驗中的 「洗滌」動作。
• 重複以上步驟 2～3 次，最後一次需把生理食鹽水倒乾淨。
• 「Test」管加入 2 滴 AHG 試劑，「Control」管加入 2 滴 6% albumin 或生理食鹽水，混勻後離心 15 秒。
• 判讀凝集價數並記錄結果；陰性反應管或弱反應管再輔以顯微鏡觀察。
• 若使用 polyspecific 或 anti-C3 之 AHG 試劑，陰性反應管需將血球搖散，繼續於室溫反應 5 分鐘後再次離心判讀（加強 anti-C3 的反應）。
• 陰性結果反應管加入 1 滴 Coombs control cells（IgG-coated RBCs），離心 15 秒後判讀，應有 1+～2+ 凝集才是有效試驗；若沒有凝集，表示 AHG 沒作用（忘記加入、過期無效或洗滌不完全使 AHG 被殘餘病人血清中和），整個過程必須重做。
• DAT 陽性時，可進一步以 monospecific antihuman globulin（對抗 IgG 或 C3d）重做 DAT，釐清血球表面附著的是 IgG 或補體。

• 對照組若有凝集，表示病人有強冷凝集素或血球有 自發性凝集（spontaneous agglutination），測試組的陽性結果不可信。
• DAT 陰性並不意味紅血球上未附著球蛋白分子：polyspecific 和 anti-IgG 試劑只能在每個細胞上有 100 至 500 個分子的 IgG 時方可測得，因此 IgG 附著少於此值的 AIHA 病人也會測得陰性。
• 若與 anti-IgG 呈陽性反應，可作 抗體沖出及沖出液鑑定，釐清血球上附著抗體的特異性。

17.2.4IAT 實驗方法：傳統三相法

檢體為加抗凝劑（EDTA 或 ACD）或不加抗凝劑的血液 2 mL。以下以抗體篩檢為例。

• 取 3 支試管，分別標示病人姓名及 SI～SIII（抗體篩檢細胞 I～III）。
• 各加 2 滴病人血清（或血漿）。
• 於 SI～SIII 管分別加入 1 滴對應的抗體篩檢細胞（2～5% RBCs），輕搖混勻。
• 離心 15 秒後判讀，目測有無凝集或溶血，記錄結果（Immediate spin, IS）。
• 將試管底部紅血球完全搖開後，於 37℃ 放置 30～60 分鐘；此步驟亦可於每管再加入 2 滴 LISS solution，則僅需於 37℃ 放置 10～15 分鐘，此為 LISS-IAT 法。
• 離心 15 秒，目測有無凝集或溶血，記錄結果（37℃ phase）。
• 將試管底部紅血球完全搖開後，洗滌紅血球 3～4 次：加入足量 3～4 mL 生理食鹽水，離心 1 分鐘，立即取出並快速倒乾，輕搖重懸；最後一次需儘量把生理食鹽水移除倒乾（最後一次洗滌後可把試管倒扣於衛生紙上）。
• 加 2 滴 polyspecific AHG 試劑，混合均勻。
• 離心 15 秒，目視及顯微鏡觀察有無凝集反應，記錄結果（AHG phase）。
• 陰性結果反應管加入 1 滴 Coombs control cells，離心 15 秒後判讀，應有 1+～2+ 陽性結果才為有效試驗，否則需重做。

• 操作步驟中 IS、37℃、AHG 任一管有陽性反應，即視為陽性結果。
• 由不同反應期的結果可推測檢體中抗體的臨床意義（見表 17-5）。

• 操作步驟中 37℃ 反應期至 AHG 判讀需 一氣呵成不中斷。
• 於 37℃ 反應期加入 enhancing solution 可縮短反應時間並提升抗體檢測敏感度；一般而言以 LISS 與 PEG 的效果較佳。但若使用 PEG 增強反應，需略去 37℃ 反應期後的離心判讀，且抗球蛋白試劑僅可使用 anti-IgG（用法及作用時間以個別試劑說明書為準）。
• IS 期的陽性凝集反應可注意是否為 緡錢狀反應：此類檢體以傳統三相法測試，較 MP 法與管柱凝集分析法更不受干擾（緡錢狀反應於 37℃ 反應後的洗滌過程即可去除）。
• 應用於配合試驗或抗體鑑定時，若欲減除無臨床意義的冷型抗體反應，可略去室溫立即離心步驟，直接執行 37℃ 加溫反應。

17.2.5IAT 實驗方法：手工凝聚胺法（MP 法）

檢體為加抗凝劑（EDTA 或 ACD）或不加抗凝劑的血液 5 mL。注意：絕對不可使用 heparin 抗凝管。

• 低離子力溶液（LIM），pH 4.6，保存於 4℃：25 g Dextrose＋1 g disodium EDTA，加蒸餾水至 500 mL。
• Polybrene（存放於塑膠瓶內、室溫保存）：10% stock solution 為 1 g Polybrene＋10 mL 生理食鹽水；0.05% working solution 為 2.5 mL 10% stock＋497.5 mL 生理食鹽水。粉末狀 Polybrene 需儲存於 0～4℃ 有乾燥劑處；開封後易潮解，建議全部泡成 10% stock 後分裝成 2.5 mL 冷凍保存。因每一批 Polybrene 濃度不同，換新試藥時需重新配成幾個不同濃度測定稀釋之 anti-D，觀察何種濃度反應最佳，一般使用 0.05% 最佳。
• Resuspending solution（玻璃瓶內、4℃ 保存）：0.2 M trisodium citrate（17.64 g＋300 mL 蒸餾水）與 5% dextrose（10 g＋200 mL 蒸餾水）混合即成。

• 取 3 支試管標示 SI～SIII，各加 2 滴病人血清（或血漿），再加入 1 滴對應抗體篩檢細胞（2～5% RBCs），輕搖混勻。
• 各加 1 mL LIM 混合，置室溫 1 分鐘。
• 加 2 滴 0.05% Polybrene，混合，靜置 15 秒。
• 離心 15 秒，把上清液倒掉，略傾斜試管目測有無凝塊（即聚合反應）。含 heparin 的檢體 Polybrene 可能需加 4～6 滴才會有凝塊；如果沒有凝塊，必須重做。
• 加 2 滴 resuspending solution，輕輕混合 10 秒：Polybrene 引起的聚合應在 10 秒內散開，若為抗原抗體引起的凝集則不易（或較慢）散開，視為陽性反應。
• 以肉眼與顯微鏡觀察有無凝集，記錄結果。
• 若需續作 AHG phase（一般不需做，除非為了測 anti-K）：再加 1 滴 resuspending solution，以 10 mM sodium citrate solution（1 份 resuspending solution 加 19 份 saline）洗滌 3 次，完全去除最後一次上清液；加 2 滴 anti-IgG，離心 15 秒判讀；如無凝集，加 1 滴 Coombs control cells 確認試驗有效。

• resuspending solution 加入後應儘速觀察結果，不可超過 3 分鐘，否則抗體凝集反應仍會消失。
• 此法抗球蛋白試劑應以 anti-IgG 代替 AHG，以免 LIM phase 時紅血球非特異性吸附補體所引起的弱偽陽性反應。
• Polybrene 是一種 anti-heparin 藥物，所以使用含 heparin 之檢體要加稍多的 Polybrene 來中和 heparin。

17.3.1ABO 血型測定

使用 monoclonal anti-A、anti-B 試劑偵測紅血球上的 A、B 抗原；使用 A1 及 B cells 試劑偵測血清中 anti-A、anti-B 抗體；依紅血球上的抗原和血清中的抗體反應定義 ABO 血型。檢體為含抗凝固劑的血（EDTA 或 ACD）1～2 mL。

• 偵測紅血球抗原（Forward typing，正向（血球）分型）：取 2 支試管分別標示 anti-A 及 anti-B，各對應加入 1 滴抗血清，再加入 1 滴 2～5% 檢體紅血球懸浮液，混合後離心 15 秒，取出輕輕搖動，目測凝集現象並記錄價數。
• 偵測血清中抗體（Reverse typing，反向（血清）分型）：取 2 滴血清或血漿至 2 支分別標示 A cell 與 B cell 的試管，各對應加入 1 滴 2～5% A 型血球試劑與 B 型血球試劑，混合離心 15 秒，觀察是否有溶血，再輕搖目測凝集並記錄價數，最後比較血清抗體反應與紅血球抗原結果。

• 依 Landsteiner's rule 判定：當檢體紅血球上帶有 A 或 B 抗原時，其血清則不會產生相對應的 anti-A 或 anti-B 抗體（見表 17-7）。
• 若紅血球上的抗原和血清中的抗體反應結果不一致，必須解決後才能判定 ABO 血型。
• 若有混合視野（mixed-field）凝集反應，必須儘可能調查原因：臨床上除亞型（例如 B₃）外，尚包括病人近期輸過 O 型 PRBC、近期接受不同血型的造血幹細胞移植、血液腫瘤病人的血球抗原減弱等。

• 一般分型時檢體紅血球可不需洗滌，直接以生理食鹽水泡成懸浮液；除非欲排除血清物質的干擾，才洗滌後再泡成 2～5%。
• 血球分型以市售 anti-A、anti-B 試劑反應可達 4+；血清分型相對反應可能較弱，且 O 型人血清分型與 A／B 血球反應多數不會差異過大。若需增強反應，可將所有反應原管內血球搖散後室溫反應 5 至 10 分鐘，再次離心判讀。
• 有的實驗室常規即加測「病人血清＋O 型血球」或／及「病人血清＋自體血球」，可第一時間發現非典型冷型抗體或自發性凝集血球。

17.3.2ABO Discrepancy 的解決

• 以原有檢體重做 ABO 血型檢驗，確認無技術失誤；此時通常先將檢體血球洗滌數次，排除血漿可能的影響。
• 若此次結果與之前血型紀錄不一致，或懷疑檢體污染，則 重新取得新檢體再重做。
• 檢視病人醫療史：年紀與歷史血型紀錄；疾病診斷（AML 病人偶有抗原減除 Ag depleted、腸道腫瘤或感染者偶見獲得性 A／B 抗原、多發性骨髓瘤病人有時血清出現緡錢狀反應）；輸血史（輸注不同血型的 PRBC、血小板或血漿成分、新生兒換血）；移植史（造血幹細胞移植供受者血型不同，可造成數個月甚至數十年的非典型血型結果，例如 minor-incompatible 的 A 型受者／O 型捐者，移植後數月血球分型可轉為 O 型、血清分型仍長期呈現 A 型；器官移植者的 passenger lymphocyte syndrome（PLS）亦應注意）；最近用藥。
• 加測病人血清與自體細胞及 O 型抗體篩檢細胞的反應，需包括與 ABO 分型方法一致的室溫立即離心法，以客觀評估是否有冷型自體抗體和異體抗體引起的血型干擾；必要時加做 DAT。

從以上訊息分析可能的不一致原因，擬定追加的實驗策略。一般而言 ABO 分型判讀價數多有 3+～4+，不如預期的弱反應往往是問題所在。初學者可從減弱的血球分型、多餘的血球分型、混合視野型、減弱的血清分型、多餘的血清分型分別推敲（見表 17-8）。

• 加測受測者血球與 anti-H 試劑的反應：血球分型為 O 型但血清分型不典型時，加測 H 抗原可很快檢出 亞孟買血型；部分亞孟買者血球與 anti-A／-B 及 anti-A,B 有肉眼可見的弱反應（可能為血清中抗原物質吸附於血球），可從血球上 H 抗原陰性與亞型者 H 抗原強陽性做區別。
• 以 延長反應時間或／及低溫加強弱 A、B 抗原和抗體的檢測：加做室溫反應 15～30 分鐘後離心判讀；若仍無凝集，再將所有試管置 4℃ 反應 15～30 分鐘後離心判讀。
• 合併 吸附沖出技術證實血球是否帶有極微弱的 A 或 B 抗原（適用於區分 O 型或某些亞型，詳見 17.4.1）。
• 加測血球與 anti-A,B 試劑的反應：某些亞型（如 Aₓ）或接受過不同血型造血細胞移植的病人，可能與此單株抗體有肉眼可見的明顯反應。
• 加測血球與 anti-A1 試劑的反應：適用於與 anti-A 反應陽性的案例調查；A 亞型（A₂、A₃ 等）者與 anti-A1 反應為陰性，若呈陽性反應則可能為輸血、移植或 Chimera 的混合血型檢體。

• 溫鹽水洗滌紅血球移除冷型自體抗體：37℃ 預溫至少 50 mL 生理食鹽水；約 1 mL 2～5% 病人紅血球懸浮液置 37℃ 加熱 15 至 60 分鐘；以溫鹽水洗滌至少 3 次；用已洗滌血球做血球分型，並加一管對照組（病人血球＋生理食鹽水或 6% albumin）。若對照組仍有反應，表示自發性凝集未被完全消除，可再以 DTT 或 AET 處理破壞血球上 IgM 抗體。
• 去除緡錢狀反應的干擾：干擾來源是病人血清，只要以生理食鹽水再洗滌血球 2～3 次、去除懸浮液中殘存的少量血清即可。

以延長反應時間或／及低溫加強弱 A、B 抗原和抗體的檢測，但務必再加做 病人血清與 O 型抗體篩檢血球的測試，以釐清是否有冷型自體抗體（例如 anti-IH）或對應之冷型異體抗體干擾。

• 鹽水取代或稀釋法（saline replacement or saline dilution）解決緡錢狀反應：保留常規 ABO 分型原管，重新離心後以滴管移除血清、留下管底血球，滴入等量（2 滴）生理食鹽水取代血清，輕搖重懸後觀察：緡錢狀反應在食鹽水中會散去，真正的陽性凝集仍可保留。
• 緡錢狀反應是因血漿蛋白成分改變讓紅血球疊成串，並不是凝集反應：可能見於 多發性骨髓瘤（IgG、IgM、IgA）、巨球蛋白症、cryoglobulinemia、肝硬化、感染（hyperfibrinogenemia），或靜脈內輸注 dextran、纖維球蛋白及 PVP 者。
• 確認 A₂ 或弱 A 亞型者產生非預期的 anti-A₁：病人自身血球應不與 anti-A1 lectin 反應（最好能取得輸血前檢體）；病人血清必須和 3 個以上之 A1 和 O cells（抗體篩檢細胞組）反應並加做自體對照；若血清與所有 A1 型血球反應、但不與自體血球、A2 和 O cells 反應，則極可能為 anti-A1，但若與 A2 或 O cells 反應，則必須調查其他非預期血清反應。
• 37℃ 孵育不離心判讀血清分型：血清與血球懸浮液分別預溫後，在 37℃ 環境下混合、靜置 1～2 小時使血球沉降，以 settled reading 方式不離心觀察有無凝集；對應 ABO 血型抗體通常足以造成凝集，但若原本血清分型即很弱可能測不到。

17.3.3–17.3.4RhD 血型測定與弱 D 試驗

RhD 測定使用 monoclonal anti-D 試劑偵測紅血球上的 D 抗原，檢體為含抗凝固劑的血（EDTA 或 ACD）1 mL。操作：將 1 滴 anti-D 滴至乾淨標示的試管，加 1 滴 2～5% 紅血球懸浮液，混合後離心 15 秒。

• Anti-D 管凝集且有 negative control，表示受試者為 D positive：現今常規使用的 anti-D 多為 low-protein monoclonal，若與 anti-A、anti-B 一起測試，anti-A／anti-B 陰性反應可視為有效 negative control；並行自體對照陰性亦為有效 negative control；或使用廠商提供的試劑對照溶液做平行測試。
• Anti-D 管無凝集，可續做弱 D 試驗；或依實驗室政策對輸血病人直接發報告為 D negative：根據 AABB 技術手冊，輸血病人可直接視為 Rh 陰性，給予輸注 Rh 陰性紅血球；但捐血者及與 Rh 免疫球蛋白（RhIG）評估相關之孕婦及新生嬰兒檢體，仍需進一步執行弱 D 試驗，以檢出帶弱 D 抗原的受測者並視為 Rh 陽性。
• 若 control 試管凝集或自體對照陽性，需小心判讀 D 抗原結果，必要時將 IgM 與 IgG 抗體從紅血球移除後重測。

• 原理：有一些 weak D 抗原，只能用 indirect antiglobulin（IAT）法才能驗出。
• 操作：1 滴 anti-D 加 1 滴 2～5% 紅血球懸浮液於試管；另管加 1 滴生理食鹽水或 6% albumin 或試劑商所附對照溶液（對照組）；依試劑說明書進行 37℃ 反應（一般 15 分鐘，37℃ phase）；離心 15 秒判讀價數；每管以食鹽水洗滌至少 3 次，最後一次儘量倒乾；每管加 2 滴抗球蛋白試劑（anti-IgG），離心 15 秒後目視及顯微鏡觀察凝集（AHG phase）；陰性反應加 IgG-coated control cells，離心 15 秒後應有 1+～2+ 陽性，以確認抗球蛋白試驗有效。
• 判讀：弱 D 試驗管凝集且 control 陰性，受試者報告為 D positive（原書註：報告「D positive」或「D negative, Du positive」都不正確）；試驗管無凝集且 control 陰性，報告 D negative；control 試管在任何 phase 凝集則為 無效測試，需將 IgG 抗體從紅血球移除後重測。

17.3.5抗體篩檢

以廠製抗體篩檢細胞組（antibody screening cells）和病人的血清反應；適用的篩檢細胞組應包含出現在 人口頻率大於 3% 的抗原，可篩檢到大部分的紅血球抗體，若病人血清中有抗紅血球抗體就會和篩檢細胞反應。

• 抗體篩檢細胞組通常為 2 或 3 瓶 O 型 2～5% 紅血球懸浮液組成；美國 FDA 規定必須含有 18 種主要 RBC 抗原：D、C、E、c、e、M、N、S、s、P1、Leᵃ、Leᵇ、K、k、Fyᵃ、Fyᵇ、Jkᵃ、Jkᵇ。
• 國內使用的國產抗體篩檢細胞組還另有 Miᵃ 與 Diᵃ 抗原、但缺乏 K 抗原，故可檢出國人較常見的 anti-“Mi” 與 anti-Dia；雖然 anti-K 可能漏失，但見於國人血清中的機會微乎其微。
• 檢體：含抗凝固劑的血（EDTA 或 ACD）2 mL，或取不加抗凝劑檢體之血清。
• 操作：取三支試管分別標示 I、II、III，各加入 2 滴病人血清（也可多加一支自體對照管 AC）；各自加入 1 滴抗體篩檢細胞 I、II、III，AC 管加入病人自體紅血球懸浮液；以選擇的 IAT 方法操作（MP 法、凝膠法或傳統三相法）。
• 判讀：與 SI～SIII 均無反應為陰性，與任何一支有反應即為陽性。

17.3.6抗體鑑定

以廠製抗體鑑定細胞組（antibody identification panel）和病人血清反應，再從陽性與陰性反應管系統性分析可能的抗體特異性。檢體同抗體篩檢；但若選用不加抗凝劑檢體之血清，可能對具體外活化補體能力的抗體有更高檢出力。

• 標示試管 1～11 及 AC，根據抗體篩檢結果選擇適當實驗方法（MP、三相法或凝膠法），將病人血清與 panel cells 反應。
• 仔細記錄每一管的反應價數——不同反應期及不同反應強度都可能成為抗體鑑定的線索。
• 參照所用 panel sheet，針對陰性反應管以 cross-out（rule-out）法排除部分抗體特異性；注意於 Duffy、Kidd、MNS 建議僅排除 雙劑量（double dose）抗原、保留單劑量（single dose）抗原，更能確保不遺漏弱反應抗體。
• 推測可能的不規則抗體特異性：先觀察是否有常見的單一特異性抗體可完全符合反應型態（價數與反應期），再推測是否有多重特異性抗體的可能組合；若不同反應期有相異特異性，可能有多重抗體需個別分析；此步驟可先針對較常見的抗體分析，暫不理會極少見的抗體。（原書表 17-10 為 rule-out 範例：典型 anti-c＋E 反應，但 panel 未能完全排除弱 Fyᵃ 與 N 抗體的可能性，而 f、V、Jsᵃ 與 Lu 抗體雖不能排除但極少見，暫不予考慮；該表文字層亂序，本站不收錄，請查原書。）
• 檢視所有陽性反應管是否與推得之抗體特異性相符、有否遺漏；特別留意是否有 非預期反應強度的某些反應管，可能意味有被遮蔽的抗體。
• 必要時再選擇其他血球或利用其他技術輔助特異性分析。
• 選出抗體特異性之後，進行病人自體紅血球對應之抗原測試：典型的異體抗體反應，病人血球 缺乏此抗體的對應抗原；注意最好能取得輸血前的檢體檢測以免干擾。

• 自體對照在 RBC 抗體鑑定十分必要：自體對照陰性通常為典型異體抗體；自體對照與鑑定細胞組均陽性則極可能為自體抗體；但需注意 輸血後檢體的混合視野型陽性反應，可能表示輸了不合的血品。
• 即使陽性與陰性反應管完全符合，仍應計算統計學上的 p 值是否 <0.05 以證實非屬巧合；血庫實驗常以挑選對應抗原 「三正三負」的血球確定抗體特異性（Rule of Three），若抗原陽性或陰性血球少見，也以尋找 二正五負或二負五正的血球代之（見表 17-11）。
• 呈 dosage effect 的抗原系統：Rh、Duffy、MN 與 Kidd——部分弱反應抗體可能只與抗原同合子血球作用，cross-out 時需注意。
• 抗原表現強度在不同個體差異較大者：I、P1、Leᵃ、Leᵇ 與 Sdᵃ——弱抗體反應案例可能與 panel 中 1～2 個對應抗原陽性血球不反應，cross-out 時需注意。
• 會被酵素破壞的抗原：M、N、S、Fyᵃ、Fyᵇ、Rg、Xgᵃ、Ytᵃ 和 Pr——部分案例可比較血清與酵素處理／未處理紅血球的反應輔助鑑定。

17.4.1–17.4.2吸附沖出法與唾液試驗

原理：一些 ABO 亞型因抗原太弱無法直接測得凝集反應，甚至經過低溫和抗體加強反應亦無法測得；紅血球上的弱 A、B 抗原需先 吸附 anti-A 或 anti-B，再由沖出法將吸附的抗體沖出，間接證實血球上有微量 A、B 抗原表現。

• 試劑：以 人類來源的多株抗體抗血清最佳；市場上無人類來源 anti-A／anti-B 販售，可依 Judd's method 自行篩檢效價高的檢體血漿（血漿稀釋 100 倍後與 A1 及 B cells 室溫反應 15 分鐘、反應價數 2+ 以上之血漿）。若使用市售單株抗體試劑，不能排除其對 pH 和滲透壓改變很敏感而不適用，需以已知亞型血球評估適用性，使用時可以生理食鹽水稀釋三倍後使用。
• 操作：受試者紅血球 1 mL 以生理食鹽水洗滌至少 3 次；加入 1 mL anti-A（懷疑弱 A 型）或 anti-B（懷疑弱 B 型）充分混合，置 4℃ 冰箱孵育 1 小時（期間偶爾混合）；同時準備一瓶生理食鹽水置 4℃ 備用；混合液離心至少 1 分鐘後移除上清液；血球移至另一乾淨試管分成 2 或 4 管，以 4℃ 生理食鹽水洗滌至少 8 次（最後一次可匯集血球離心）；移除生理食鹽水，保留少許最後一次上清液（last wash）與沖出液做平行測試。
• 沖出：取等量 6% albumin 加至已洗滌血球，混合均勻後置 56℃ 作用 10 分鐘（經常混合或至少每兩分鐘攪動一次）；離心 2～3 分鐘，儘快取出紅色上清液（heat elution 沖出液）。
• 測試：沖出液及最後一次上清液分別與 3 個 A 或 B 型紅血球及 3 個 O 型對照紅血球作用：先室溫立即離心判讀，陰性則加做室溫反應 15～30 分鐘後離心判讀，再陰性則於 37℃ 反應 15 分鐘後作至抗球蛋白試驗判讀。

• 判讀——血球上有微量 A 或 B 抗原：必須同時符合 3 個條件，即 沖出液在任一反應期與 3 個抗原陽性之 A 或 B 型血球皆反應、沖出液與 3 個 O 型血球皆無反應、最後一次上清液與 A／B／O 血球皆無反應。
• 血球上無 A 或 B 抗原：沖出液與抗原陽性血球皆無反應（但也可能是沖出過程不正確）。
• 無效實驗：last wash 與 3 個抗原陽性 cells 反應，表示洗滌過程不完全，eluate 為 invalid。
• 沖出液與 O 型血球有反應或全部有反應：可能表示血球上原本即有非 A／B 之其他抗體。
• 若無亞型檢體可評估抗血清，可以 人工混合 3%～5% A1 或 B 型 RBCs 至 O 型 RBCs 作 positive control，以 O 型 RBCs 作 negative control 同時測試。

原理：約 78% 的人擁有 Se 分泌型基因，其除脊髓液外的體液皆含水溶性 ABH 抗原。利用 血球凝集抑制（hemagglutination inhibition, HI）法，把唾液中水溶性的 A、B、H 物質和已知對抗這些抗原的抗體中和，再加入 A1 cells、B cells 或 O cells，若這些細胞凝集就表示唾液中不含該抗原。A 型分泌型口水應有 H 及 A 抗原，B 型分泌型有 H 及 B 抗原，O 型分泌型有 H 抗原。

• 檢體處理：受測者刷牙或漱口後收集 3～5 mL 唾液（可嚼 wax、paraffin 或乾淨橡皮圈促進分泌，但不可嚼口香糖或含糖、蛋白質的成分）；以 1000×g 離心 8～10 分鐘，上清液移至玻璃試管於沸水中煮 8～10 分鐘破壞酵素活性；再次離心 8～10 分鐘，取清澈或乳白色上清液以等量生理食鹽水稀釋；數小時內可測試者置 4℃ 冷藏，否則冰凍於 -20℃ 可保存數年。
• 試劑準備：以生理食鹽水將 anti-A 與 anti-B 做兩倍系列稀釋至 1,024 倍（最好用 human 來源血清或經評估適用之單株試劑）；市售或自製 anti-H lectin 一般稀釋至 2 或 4 倍即可；各取一滴稀釋抗血清與一滴對應 A 或 B 型 2～5% 紅血球懸浮液（稀釋 anti-H 與 O 型血球）離心觀察，選擇達 2+ 反應之最高稀釋倍數，記錄作為下次使用同一試劑的參考。
• 操作：標示陽性對照、陰性對照、測試組及空白對照四組試管，各加一滴已適當稀釋之 anti-A、anti-B、anti-H 血清；測試組各加一滴處理過的唾液、空白對照各加一滴生理食鹽水，陽性與陰性對照組加入已知分型用於品管的唾液（陽性對照用已知分泌型者如 AB 型；陰性對照優先使用已知非分泌型者，無法取得時可權宜以弱分泌型者或 B 型與 A 型者唾液分別作 anti-A 與 anti-B 管的陰性對照；建議已知分型者唾液平日即處理備妥、分裝冷凍保存）；混合後室溫反應 8～10 分鐘；加 1 滴 2～5% 對應 ABO 紅血球懸浮液（指示血球）；室溫反應 30～60 分鐘後離心、肉眼觀察凝集。

品管邏輯：陽性對照組（稀釋 anti-A＋AB 型分泌型者 saliva＋A cells）應不凝集、陰性對照組（稀釋 anti-A＋非分泌型者 saliva＋A cells）應凝集，與預期相符實驗才有效。空白對照組應有凝集，若無凝集表示實驗 invalid（通常是血清稀釋太過），需重新配製稀釋血清。檢測 B 抗原改用 anti-B 與 B cells；檢測 H 抗原物質改用 anti-H 與 O cells。

• 抗血清需適度稀釋，以免唾液物質無法中和掉全部抗體（反應管中剩餘的抗體與指示血球反應）而 誤判為陰性。
• 若唾液中均無法測得 A、B、H 抗原物質，受測者可能為非分泌型或弱分泌型；國人中最可能的狀況為弱分泌型（唾液中 ABH 血型物質含量極低）。進一步證實方法：測血球上的 Lewis 抗原；測唾液中的 Lewis 抗原物質（方法與測 H 物質相同，見表 17-13）；增加 anti-A、anti-B、anti-H 的稀釋倍數或縮短 inhibition test 的室溫反應時間，取得空白對照組陽性但實驗組陰性的反應條件，證實唾液中極微量的 ABH 血型物質。

17.4.3–17.4.4酸沖出與 ZZAP 處理血球吸收試驗

酸沖出利用 降低 pH 值使抗原抗體之間靜電吸引力喪失，並改變蛋白質三級結構使結構互補性喪失。此法從紅血球解離 IgG，但 不影響 RBC 細胞膜抗原之完整性，適用於自體溶血性疾病及輸血反應之探討、DAT 陽性血球之抗原分型或自體吸收。

• 沖出劑：citric acid monohydrate 1.3 g＋KH₂PO₄ 0.65 g，加 0.9% saline 至 100 mL，pH 2.7，保存於 4℃。
• 中和液：Na₃PO₄·12H₂O 30 g（或 Na₃PO₄ 13 g）加去離子水至 100 mL，保存於 4℃。
• 5% albumin：2.5 mL 22% albumin＋8.5 mL saline。
• 檢體：紅血球濃厚液 1 mL 以上，以 saline 清洗 6 次，保存最後一次上清液作 negative control。

• 操作：所有試劑使用前保存於 4℃；取 1 mL 紅血球濃厚液，加入 1 mL 沖出劑，上下混合並開始計時 90 秒（要準確，否則 RBC 容易溶血）；離心 1 分鐘；將上清液（沖出液）移至乾淨試管（紅血球立刻以 5% albumin 洗 2 次、再以 saline 洗 2 次——若 DAT 轉為弱陽性或陰性，即可做紅血球 phenotyping 及自體抗體吸收）；測定 pH，將沖出液以中和液一滴一滴調至 pH 7；離心 2 分鐘除去沉澱物；取上清液，每 1 mL 沖出液約加 6 滴 22% albumin 做抗體鑑定。
• 判讀：沖出液與所有試劑血球反應，極有可能為 自體抗體（尤其病人近期未輸過血）；與部分試劑血球反應，為具特異性之不規則抗體；與所有試劑血球均無反應，可能為非特異性吸附的球蛋白，亦可能為藥物相關抗體、低頻率 RBC 抗原的對應抗體或 anti-A／anti-B，需再從病史及追加實驗推測。
• 注意：此方法處理的血球 不適用於測 Kell 血型抗原（citric acid 處理後 Kell 抗原表現會變弱）；在 HDFN 或溶血性輸血反應案例，從 DAT 小於 1+（IgG coated）的血球上往往即可測得血清中測不到的抗體；沖出後的血球必要時可以酵素處理後進行自體吸收，但血球溶血會比較嚴重。

ZZAP 試劑主要由 dithiothreitol（DTT）與 cysteine-activated papain 以 phosphate buffer 調配組成，主要用於移除血球上附著的抗體與補體，增強自體吸收的效能；若用於異體吸收，亦可藉破壞部分血球抗原、保留其對應抗體於吸收後血清的效果。

• 試劑：1% cysteine-activated papain 或 1% ficin；phosphate-buffered saline（PBS）pH 7.3；0.2 M DTT（1 g DTT 溶於 32.4 mL pH 7.3 PBS，分成每份 3 mL 儲存於 -18℃ 以下）。
• 操作：ZZAP 試劑為 1% cysteine-activated papain 0.5 mL＋0.2 M DTT 2.5 mL＋PBS 2 mL（或以 1% ficin 1 mL＋0.2 M DTT 2.5 mL＋PBS 1.5 mL）混合；取 2 支試管各加 1 mL 自體血球（不需先洗）與 2 mL ZZAP 試劑，37℃ 反應 30 分鐘（期間混合數次，以做兩次吸收為例）；血球以 saline 洗 3 次，最後一次離心至少 5 分鐘並儘可能移除上清液（避免稀釋血清）；其中一管加入 1 mL 病人血清，37℃ 反應 30～45 分鐘（第一次吸收）；離心取出「吸收後血清」，需要時移至另一管 ZZAP 處理過的血球再吸收（第二次吸收）；取吸收後血清進行異體抗體篩檢，若仍有反應需判斷是否吸收不完全，視需要增加吸收次數。
• 判讀：吸收後血清與試劑血球無反應——可能無異體抗體；部分陽性——有異體抗體，可選擇數個適合血球鑑定特異性；全部有反應——可能 吸收不完全（可再吸收 1～2 次；即使不完全，降低自體抗體反應強度後也有助於檢出異體抗體），或有對抗 high-incidence antigen 的異體抗體（可從病史及自體血球 DAT 價數推敲）；吸收後血清反應強度完全沒有減弱——可能因此病人的自體抗體（例如 anti-Kpᵇ）不與 ZZAP 處理過的血球反應，替代方案可以未處理或僅用 1% 酵素處理的血球進行自體吸收。

17.4.5–17.4.6T 抗原測定與木瓜精處理血球

T 多重凝集可見於部分細菌感染患者：細菌所釋放的 neuraminidase 把紅血球表面的隱藏抗原暴露出來，可與正常成年人血清中的 anti-T 反應。花生水（anti-T lectin, Arachis hypogaea）可幫助診斷 T 抗原的多重凝集。

• 花生水泡製：生花生去殼研磨磨細，加等量 saline，混合後放置 4℃ 至隔夜；離心 10 分鐘，吸取並丟棄上面油層；上清液以濾紙過濾；再離心 10 分鐘，將上清液取出測力價：選擇與 positive cell 有 4+ 反應結果的數個倍數，再做 1:100 稀釋，需有 1+ 反應的該支之原始稀釋倍數作為最終選擇之稀釋倍數（working solution）。剩餘花生水 stock solution 可加入 10% sodium azide 避免長菌（終濃度 0.1%），以每份 0.3 mL 分裝貯存於 -18℃ 以下；每次解凍泡成 working solution 後先測價數——1 滴 positive control cells 加 2 滴花生水，離心 15 秒，需有 4+ 的反應。
• Positive control（T 抗原陽性 RBC）：取 0.01 mL（10 μL）neuraminidase 加到 6 mL 已洗滌過的 25% RBC 中（即 1.5 mL packed RBC 加入 4.5 mL saline；neuraminidase 為 Gibco Lab，catalog no. 840-7050，貯存於 4℃）；混合後置室溫 30 分鐘（期間混合 2 次）；saline 洗 3 次後取少許泡成 2～5% 血球懸浮液；1 滴 RBC 加 2 滴花生水，離心 15 秒需有 4+ 反應；剩餘 T 抗原陽性 RBC 可分裝少量冷凍甘油紅血球保存，需要時再解凍使用。
• 檢體：EDTA 的血 0.5 mL，或 heparinized capillary 一支。
• 操作：病人血球以 saline 洗 3～5 次，泡成 2～5% 細胞懸浮液；取 1 滴病人血球加入 2 滴解凍後未稀釋之花生水；離心 15 秒觀察結果；如為陰性反應，室溫靜置 5 分鐘後再離心 15 秒觀察。
• 判讀：陽性反應表示血球為 T 的活化（T 多重凝集）；陰性反應表示無 T 的活化。

酵素可以加強及減弱某些紅血球抗原。配製 enzyme treated cells 可作為 two-stage 酵素實驗的第一個處理步驟，或作為吸附自體抗體的血球處理。

• PBS pH 7.3：Na₂HPO₄·12H₂O 26.89 g 加蒸餾水至 500 mL；NaH₂PO₄·2H₂O 2.3 g 加蒸餾水至 100 mL；取前者 410 mL 與後者 90 mL 混合，pH 應為 7.2～7.4，再加入 500 mL saline。
• 1% 木瓜精 stock solution：1 g 木瓜精加 100 mL saline，用力震盪混勻，分裝少量（約 1 mL）貯存於 -18℃ 以下冷凍櫃。
• 0.1% 木瓜精 working solution：1 份 1% stock 加入 9 份 PBS pH 7.3。
• 操作：1 份 PBS 洗滌過的紅血球濃厚液加入 2 份木瓜精使用液，混合；37℃ 反應 10～15 分鐘；洗紅血球 3 次後泡成 2～5% 細胞懸浮液；取 1 滴血球懸浮液加入 2 滴血清，在特定條件下作用 10～15 分鐘（4℃／室溫／37℃）；離心 15 秒判讀結果。
• 注意：使用酵素處理過的血球做血清學實驗通常 僅用肉眼判讀、不需顯微鏡，避免偽陽性反應。品管：處理後血球與自體血清不應呈現凝集（若有則表示處理時間過長），並測試預期處理後會增強與減除的抗原（例如 Jkᵃ 與 M 抗原）。

17.4.7–17.4.10抗體力價測定、血小板／顆粒球抗體檢測與試劑泡製

力價之測定是半定量式地測定血清中抗體的含量：用 2 倍系列稀釋的血清和一定量的紅血球作用，以 最高稀釋倍數仍發生紅血球凝集來表示抗體的含量。

• 操作：取 10 支試管標明 2×～1024×，每管加入 0.5 mL 生理食鹽水；第一管放入 0.5 mL 病人血清；充分混合後取出 0.5 mL 放入第二管，如此類推做到第十管；再取 10 支試管，各以微量吸管自對應稀釋管取出 100 μL 稀釋血清置入；每管加入 50 μL 對應 2～5% 紅血球懸浮液；以選定的血清學方法測試並記錄結果；取看到凝集 1+ 的最高稀釋倍數為抗體力價（例如第五管 1:32 為 1+ 最高稀釋倍數，則記錄 titer=32）；若最後一管尚有 1+ 或以上凝集，必須再繼續稀釋下去。
• 為降低誤差，至少取 0.5 mL 血清做系列稀釋，且實驗中以 pipette 取代常規滴管。
• 為達最佳實驗再現性：最好從同一個供血者準備新鮮血球（或至少選表現型相同的血球）；每管間務必換用新的 pipette tip；肉眼觀看凝集結果時從稀釋倍數最高的開始看（1,024 倍起）；反應時間、溫度及離心條件決定後，同一 case 每次稀釋需用同樣條件。
• 如兩個血清要比較力價，必須 同時做稀釋與反應；若第一次的血清可能以後要再比較，必須保存在 -30℃；兩次力價的差異要有 兩支試管以上的不同才有意義。

以動物來源的 anti-thrombocyte antibody 將血小板（PRP）固定在微量盤上；病人血清中含 anti-platelet antibody（IgG）時會與 PRP 結合，再加入 anti-IgG-coated indicator red cells 吸附於微量盤內即可判讀。

• 材料：血小板 PRP（由捐血中心供應約 8 袋血小板血品之血段擷取，或自捐血者抽血以 EDTA 或 ACD 抗凝、200×g 離心取 PRP）；positive control serum（anti-Pl serum）及 negative control serum；病人血清 3 mL；已吸附 anti-thrombocyte antibody（動物來源）的 U 型 microplate；0.3% anti-IgG-coated indicator red cells 懸浮液；1.9% glycine（蒸餾水配）。
• 操作：微量盤以 saline 洗滌 3～4 次；捐血者 PRP 以 saline 稀釋後各滴 2 滴到每個反應槽；45×g 離心 5 分鐘（使血小板在反應槽內形成 platelet-monolayer）；saline 洗滌 5～6 次；分別加入 1 滴病人血清、positive control、negative control serum；加入 1.9% glycine 各 3 滴；輕微均勻混合 1 分鐘；37℃ 溫箱 30 分鐘；saline 洗滌 5～6 次；加入 1 滴 0.3% anti-IgG-coated red cells（指示紅血球）；700×g 離心 1 分鐘後判讀。
• 判讀：陽性反應——槽內紅血球散開呈霧狀（指示紅血球與血小板層結合）；陰性反應——紅血球集中於一點（未結合於血小板層，離心後沉降槽底）。

測定血液中顆粒球抗體的試驗，稱 granulocyte indirect immunofluorescence test（簡稱 GIFT）：利用螢光抗體法測定病人是否有顆粒球的自體或異體抗體。將分離出的顆粒球以 1% paraformaldehyde 固定，再用 FITC-labelled Fab 的抗球蛋白試劑測定血清中顆粒球抗體，以螢光顯微鏡觀察。

• 主要材料：Ficoll isopaque solution（比重 1.077）；0.1% fetal calf serum（FCS，以 PBS 稀釋）；NH₄Cl 溶液（NH₄Cl 8.3 g＋KHCO₃ 1 g＋EDTA 0.037 g，加蒸餾水至 1,000 mL，pH 7.0～7.4，4℃ 保存）；paraformaldehyde（4% stock：20 g PFA 加 PBS 至 500 mL、70℃ 水浴加熱助溶，過濾調 pH 至 7.25；1% working 以 PBS 稀釋）；FITC-conjugated 試劑（FITC-labelled F(ab')₂ 或 anti-human IgG／IgM 的 Fab，以 PBS 1:25 稀釋；FITC-goat anti-mouse 以抗體稀釋劑稀釋）；glycerol PBS（3 份 glycerol＋1 份 PBS）。
• 操作概要：EDTA 抗凝血 4 mL 以 PBS 稀釋 2 倍，緩緩加於 Ficoll 上；1000×g 離心 20 分鐘（顆粒球與紅血球在底部）；NH₄Cl 溶血（碎冰 10～15 分鐘）；250×g 離心 5 分鐘吸掉上清；1% FCS 洗 3 次（第 3 次換玻璃試管）；加 1 mL 1% PFA 室溫固定 5 分鐘；以 FCS 調整細胞數至 10×10⁶/mL；取 25 μL cell＋25 μL 血清輕搖混合，室溫 30 分鐘；FCS-PBS 洗 3 次；加 FITC-labelled F(ab')₂ 抗球蛋白試劑 25 μL，室溫 30 分鐘（避光）；再洗 2 次；加 20 μL glycerol-PBS，各取 1 滴至玻片，螢光顯微鏡下觀察並記錄反應價數。
• 注意：需平行做 positive control（mouse anti-FcR III）與 negative control（AB 型血清）；此試驗至少需選擇 四個不同健康人的顆粒球作為抗原來源，並先以抗血清測試其抗原分型。

• Coombs control cells：取 3 個 O 型 RhD 陽性血袋各 1～2 截血段；每個血段各取 4 滴血球共 12 滴，saline 至少洗 3 次（每次洗滌換新滴管）；anti-D 稀釋 1:100（saline 5 mL＋anti-D 0.05 mL；以 IgG 抗體為主的 anti-D 較適合，稀釋倍數依製造批號調整，以 DAT 結果 2+～3+ 為準）；加入 0.25 mL 洗過的紅血球，37℃ 作用 30 分鐘（每 5～10 分鐘混合一次）；saline 至少洗 3 次後泡成 2～5% 懸浮液；品管——P 管加 2 滴 AHG 應有 2+～3+ 凝集，N 管加 2 滴 saline 應無凝集，符合始可使用。泡製完成之血球懸浮在 saline 只能保存 2～3 天，以紅血球保存液泡製可保存 1 個月；保存期間觀察到有溶血需重泡。
• A cells 及 B cells：取 3 個 A 型及 B 型 RhD 陽性血袋各 1～2 段血段（泡製前可先重測血型）；等量同血型血球混合，saline 洗 3 次；1 滴洗過的 packed cells 加 32 滴 saline 泡成 3% 懸浮液；保存在 2～6℃，saline 中可保存 2～3 天。